(一)实验室检查：
1.血生化、血常规
可见电解质紊乱，常有低钾，低钠及低蛋白血症，血清白蛋白要低于3%，白细胞计数可高达20×109/L以上，且以中性细胞为主。
粪便常规
2.粪常规检查
仅有白细胞，肉眼血便少见。将粪便涂片镜检，若发现革兰阳性杆菌及其芽孢将对临床判断很有帮助，随后可进行分阶段细菌培养，检查有无大量革兰阳性菌。
3.细菌学检查
90%的病例在发病时粪便中可培养到难辨梭状芽孢杆菌，送检时为了减少与空气的接触，必须采取至少多于容器容量的新鲜粪便，连同容器置于加盖密封的广口瓶内，于20min内速送检验，取CCFA专用培养基(由环丝氨酸，噻吩甲氧头孢霉素，果糖和蛋白质琼脂组成) 接种，在厌氧条件下有选择性的分离难辨梭状芽孢杆菌，若菌落呈扁平，边缘不规则，粗糙状，革兰染色为阳性杆菌即可作出诊断。
4.细胞毒素的毒性实验
稀释的大便或细菌培养滤液，对组织培养细胞(HELA)有特异性的细胞病理效应，这种效应可被污泥梭状芽孢杆菌的抗毒素中和，从而证实难辨芽孢杆菌为产毒菌株。
5.毒素A的检测
可以用对流免疫电泳，酶联免疫吸附实验，乳胶凝集实验，单克隆抗体方法等检查毒素A。
(二)内镜检查
及时进行内镜检查不仅能早期明确诊断，还能了解病变的范围和程度。一般认为即使伪膜性肠炎急性期也应行结肠镜检查，但应注意结肠粘膜充血水肿，组织变脆，易造成出血或穿孔，检查应特别小心。伪膜性肠炎内镜下表现不一。轻者可仅见粘膜充血水肿，血管纹理不清，呈”非特异性肠炎“表现;稍重者可见粘膜散在浅表糜烂，伪膜呈斑点样分布，周边充血;严重病例伪膜呈斑片状或地图状，伪膜不易脱落，部分脱落区可见溃疡形成。伪膜性病变主要累及左侧结肠或全结肠，少数累及回盲部。
(三)X线检查：
腹部X线平片无特殊发现，可显示肠麻痹或肠曲扩张，可见液平面，由于结肠水肿，可出现拇指样印迹，偶而可出现自发性巨结肠，钡剂X线，在早期或轻型患者无特殊改变，晚期和重病者，可见结肠蠕动增快，粘膜增厚，肠曲痉挛，扭曲，粘膜溃疡等，钡剂灌肠常可使病情加重，故一般不主张施行。
(四)超声诊断
超声能发现局部肠壁假膜，黏膜及黏膜下水肿导致的重度增厚，肠腔变窄或消失，仔细探查可于右下腹发现似肠结核或肿瘤的假肾征，条件好的超声诊断仪还能更准确地分辨病变相关的层次，除此之外，超声诊断能发现疾病伴发的腹水等。
(五)CT诊断
CT的表现不具有特异性，偶可发现低衰减的增厚的肠壁。
1﹒肠扭转或肠套叠复位术后
肠扭转或肠套叠造成肠管缺血、缺氧，在血循环改善后，由于毒素吸收出现高热及腹泻，有时需和假膜性肠炎鉴别。肠扭转或肠套叠复位术后出现的腹泻来自于肠道积存的内容物，腹泻的次数和量少于假膜性肠炎而且不会越来越多，内容物含的有形成分也多于假膜性肠炎，尽管可以有短暂的全身中毒症状但总的趋势呈逐渐缓解。大便不会出现典型的水样，更不可能有假膜，细菌涂片或培养不以球菌为主，也无难辨梭状芽胞杆菌。
2﹒溃疡性结肠炎
溃疡性结肠炎往往有长期腹泻史，严重者每日可有十多次水样便，少数急性起病者发病急骤，可有全身严重的毒血症状，广泛的结肠病变可有中毒性巨结肠表现，直至发生肠穿孔和弥漫性腹膜炎。溃疡性结肠炎的病变以结肠、直肠为主，缺少假膜性肠炎的致病原因，有反复发作的趋势，粪便检查没有假膜和相关病原体，粘膜所见为多发性溃疡及息肉，钡灌肠、X 线检查和结肠镜检查有助于做出诊断。
3﹒还应注意与克罗恩病或急性出血性肠炎鉴别。
