１.直接涂片
从溃疡基底部或边缘取材，在玻片上作涂片，干燥后加热固定，革兰染色，用10×100倍油镜检查可见阴性短杆菌，菌体长约1.6～20μm，宽0.5μm，两端圆，成堆或链状排列，也有散在、无芽孢，可出现假阳性或假阴性，从腹股沟淋巴结溃疡处取材阳性率更高。
２.分离培养
杜克雷菌对外界抵抗力很弱，标本离体后应尽快接种，或放置运送培养基中，在一周内必须接种，敏感性约80%。对生长的菌落做生化反应鉴定，杜克雷菌氧化酶试验（＋），或弱阳性，硝酸盐还原实验（＋）。
１.梅毒硬下疳
潜伏期2～3周，溃疡基底硬、不痛，血清梅毒反应阳性可作鉴别。但应注意两病同染。
２.生殖器疱疹
病史中初起为红斑上簇集小水疱，有灼热感，常反复发疹。
３.Behcet 病
除生殖器溃疡外，伴有口腔溃疡、眼病变和皮肤血管炎、皮肤同形反应等特点，加不洁性史和实验室检查可作出鉴别。
