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确诊支原体感染有赖于实验室诊断。常用的有支原体培养、特异性抗体检测、代谢抑制试验、DNA探针和PCR技术等，以培养最为可靠，PCR技术最为敏感。男性患者可取泌尿生殖道分泌物、前列腺液、精液等，
确诊支原体感染有赖于实验室诊断。常用的有支原体培养、特异性抗体检测、代谢抑制试验、DNA探针和PCR技术等，以培养最为可靠，PCR技术最为敏感。男性患者可取泌尿生殖道分泌物、前列腺液、精液等，定量培养可取初段尿、中段尿。女性除宫颈和阴道拭子外，羊水、尿道分泌物也可用于检测。若要检测特异性抗体，可采集血液标本。
本病应与淋菌性尿道炎、真菌、滴虫或其他细菌感染相区别。
