１.活体组织检查
取距肛门齿状线3cm以上直肠组织，病理检查发现有异常增生的神经节纤维束，但无神经节细胞，此为诊断金标准。
２.X线平片以及钡灌肠腹部立位平片
多显示低位结肠梗阻。钡剂灌肠侧位和前后位

１.活体组织检查
取距肛门齿状线3cm以上直肠组织，病理检查发现有异常增生的神经节纤维束，但无神经节细胞，此为诊断金标准。
２.X线平片以及钡灌肠腹部立位平片
多显示低位结肠梗阻。钡剂灌肠侧位和前后位照片中可见到典型的痉挛肠段和扩张肠段，排钡功能差，24小时后仍有钡剂存留，若不及时灌肠洗出钡剂，可形成钡石，合并肠炎时扩张肠段肠壁呈锯齿状表现。新生儿时期扩张肠管多于生后半个月方能对比见到。若仍不能确诊则进行以下检查。
３.肛门直肠测压法

１.新生儿期
（１） 胎粪塞综合征（胎粪便秘）
由于胎粪浓缩稠厚可出现一过性低位肠梗阻症状，经灌肠排出胎粪后，即可正常排便且不再复发。
（２）先天性肠闭锁
新生儿回肠或结肠闭锁，表现为低位肠梗阻症状，直肠指检仅见少量灰白色胶冻样便，用盐水灌肠亦不能排便。腹部直位平片可见整个下腹部无气，钡剂灌肠X线造影可明确诊断。
（３） 新生儿坏死性小肠结肠炎
与先天性巨结肠伴发小肠结肠炎者很难鉴别。本病多为早产儿，围生期多有窒息、缺氧、感染、休克的病史，且有便血。X线平片示肠壁有气囊肿和（或）门静脉积气。
２.婴儿和儿童期
（１） 继发性巨结肠
肛门、直肠末端有器质性病变，如先天性肛门狭窄、术后疤痕狭窄或直肠外肿瘤压迫等使排便不畅，粪便滞留，结肠继发扩张。经肛诊可以确诊。
（２）特发性巨结肠
该症与排便训练不当有关，特点是患儿直、结肠有正常的神经节细胞。表现为无新生儿期便秘史，2～3岁出现症状，慢性便秘常伴肛门污便，便前常有腹痛。肛诊感觉除直肠扩张积便外，一般触不到痉挛段，直肠肛门测压有正常阳性反射。
（３）功能性便秘
是一种原因不明的慢性便秘，分为慢传输型、出口梗阻型及混合型。表现为排便次数少、排便费力、粪质较硬或呈球状、排便不尽感，有时需借助人工方式（手抠）来协助排便。诊断需钡剂灌肠或肠镜检查排除器质性疾病。

1.X线
阴性，结肠充气较多或低位结肠梗阻。
2.胃肠道造影
禁忌行口服钡餐造影。钡灌肠检查：远端结肠对称性狭窄，近端结肠扩张并伴功能障碍，新生儿巨结肠常无狭窄段可见而主要表现为钡剂潴留。